蔡军

(焦作多生多化工股份有限公司,河南  焦作 454100)

　　摘要：本文使用阳离子聚丙烯酰胺直接固定产丙烯腈水合酶休眠菌株，使之凝聚成无定形微团，然后催化丙烯腈进行水合反应生成丙烯酰胺。并通过与海藻酸钡包埋法和游离细胞法的比较证明，本方法具有与底物接触表面积大、反应效率高、操作简便、稳定性好、投资少等特点。

　　关键词：凝聚法； 腈水合酶；固定化细胞；聚丙烯酰胺；丙烯酰胺

　　Study on Immobilization of the Cell of  Niteile Hydratase by Flocculation

CAI  Jun

(Jiaozuo Duoshengduo Chemical Co Ltd, Jiaozuo  454100,China)

    Abstract: It was introduced that the dormancy cells of niteile hydratase were immobilized using the cationic polyacrylamide flocculating the cells to micro-clusters, which were used to catalyze the hydration of niteile to acrylamide. Compared with the immobilized-cell in barium-alginate gel and free-cell, the method increased the reduced surface area of the cell clusters, the stability of the enzyme and the reaction rate, so the process was simplified and the cost was reduced.
   
    Key words: flocculation;niteile hydratase; immobilized-cell ; polyacrylamide; acrylamide

　　丙烯酰胺(简称AM)是重要的酰胺类化合物，其均聚物和各种共聚物统称聚丙烯酰胺(简称PAM)，具有絮凝、增稠、减阻、阻垢和稳定胶体等性能，在国民经济中占有重要地位。广泛应用于石油开采(油田二、三次开采)、水处理剂(净化水和污水处理)、土壤改良剂、化学灌浆剂、纤维改性剂、矿物浮选沉降剂等，素有“百业助剂”之称。微生物法生产AM工艺是国际上于上世纪八十年代开发成功并实现工业化生产的原始性创新技术，此项技术的工业化成功，是石油化工骨干产品利用酶催化技术成功的第一范例，具有划时代意义。与化学法相比，微生物法生产AM在原料丙烯腈(简称AN)的转化率、产品质量、三废排放和设备投资等方面具有明显的优越性，因此越来越受到国内外有关企业和科研单位的关注[1]。

　　文献报道的微生物法生产AM工艺中的产AN水合酶菌株催化形式主要有三种：①PAM包埋法；②海藻酸钡(钙)凝胶包埋法；③游离细胞法。①、②方法的主要缺点是固定化细胞与底物的相互作用受到的空间位阻大、固定化成本高、凝胶易溶胀、细胞易流失、生产周期长、酶活利用率低等。为降低固定化成本和提高反应速率，且随着高产AN水合酶菌株的选育、发酵设备的放大等技术的实现，发酵液成本已变的十分低廉，于是近两年来又出现了采用游离细胞法生产AM的厂家。具体做法是游离菌体被悬浮于底物溶液中，使底物和反应产物较易于通过细胞膜，从而提高了反应速率。主要的发酵液和AM水合液分离设备为蝶片离心机或微(超)滤膜(中空纤维膜，卷式膜等)。但是，此法存在设备投资大、操作费用高、操作繁琐、细胞再利用难，以及在催化水合反应过程中，游离细胞裸露在高浓度的AN环境中易中毒失活、高速的返混使细胞易受损伤、产生的细胞碎片等杂质对后段工序造成影响等缺点[2，3]。

　　本文作者成功的将凝聚法直接固定化细胞工艺运用到微生物法AM生产中。选用的凝聚剂为阳离子PAM，利用PAM的物理作用(架桥、吸附等)和化学作用(中和电荷)来固定产AN水合酶休眠菌株，菌体被PAM凝聚包容并结成无定形微团，不仅能有效去除发酵液中的电解质、发酵次级代谢产物和残留培养基等杂质，而且可降低腈水合酶对外部恶劣环境的敏感性，提高其稳定性。本方法具有操作简单、与底物接触表面积大、反应效率高、细胞的耐受力强和酶活半衰期长等特点。同时，PAM作为AM的下游产品，不易对AM产品质量造成太大的影响。本工艺已在万吨AM生产装置上使用三年，运行平稳、产品质量良好。本文主要介绍凝聚法生产AM在实验室的做法，并通过与海藻酸钡凝胶包埋法和游离细胞法的比较进行评价。

　　1.实验材料和方法

　　1.1材料

　　1.1.1菌株：产AN水合酶菌株HD9611，焦作多生多化工股份有限公司选育。

　　1.1.2海藻酸钠：青岛明月化工公司生产，食品级。

　　1.1.3 PAM：法国SNF公司生产。

　　1.1.4其余试剂均为市售分析纯或化学纯。

　　1.1.5试验设备：102G型气相色谱仪、CJJ-931型四联体磁力搅拌器、针筒造粒器、1000mL间歇式生物反应器、80-2型离心机、XSZ-G型电子显微镜，721型可见光分光光度计等。
　　1.2方法

　　1.2.1游离细胞的制备

　　取发酵液50mL，装入离心管4000rpm离心20min，倾去上清液，加去离子水搅拌后，重新离心，此过程重复3～5次。

　　1.2.2海藻酸钡凝胶的制备

　　取1g海藻酸钠和49mL去离子水配成溶液，再加入1.2.1步制得的湿菌体，以磁力搅拌器搅拌混合均匀。将上述混合液加入到针筒造粒器中，向搅拌下的1.5M的无菌BaCl2溶液均匀滴注，2～4℃固化20h，取出用去离子水清洗3～5遍，制得直径3～4mm的珠型固定化细胞，2～4℃保存备用[4]。

　　1.2.3凝聚法固定化细胞的制备

　　取50mL发酵液，加入配置好的不同种类和浓度的各种PAM(阴离子型、阳离子型、两性离子型和非离子型)溶液，空气鼓泡搅拌使菌株凝聚成大团，倾去清液，将菌体絮团用去离子水清洗3～5遍，备用。

　　1.2.4催化水合反应

　　将3种方法制得的细胞加入1000ml反应瓶中，控制一定的搅拌速度和反应温度，流加AN使AM的累积浓度到25～40%，反应结束的标志为AN的浓度降至0.1%以下，然后计算AM的累积速度和累积量。

　　1.2.5细胞的回收利用

　　海藻酸钡凝胶法：将凝胶颗粒从反应瓶中取出，用去离子水清洗至无AM，清洗液倒入水合液，凝胶颗粒重新入反应瓶反应。