游离细胞法：将水合液倒入离心管离心20min，倾出上清液再加去离子水清洗，再离心，直至清洗液中无AM，清洗液倒入反应液，菌体入反应瓶开始下一次反应。

　　凝聚法：加入一定量浓度为0.35%的PAM溶液，鼓泡使菌体重新凝聚成大团，移出菌体絮团，用去离子水清洗至无AM，清洗液倒入反应液，菌体絮团入反应瓶重新反应。

　　1.2.6丙烯酰胺浓度的测定：

　　取1ml过滤后的反应液加入离心管中，6000rpm离心10min，用精密移液枪取0.5ml反应上清液与0.5ml 40.000g/L的乙酰胺混合，振荡均匀，在气相色谱上分析AM的生成量。

　　1.2.7菌株的分类学鉴定和水合液中游离菌体的分布情况的观察

　　主要以《伯杰氏系统细菌学鉴定手册》[5]和革兰氏染色法[6]。

　　1.2.8细胞酶活力测定方法

　　取100ml发酵液制得的三种细胞总量的1.0%和19ml磷酸钾缓冲液，加入到150ml具塞三角瓶中，在振荡器中振荡至28℃恒温后，用精密移液枪准确移入1000ulAN后，振荡反应5min，加入1ml4NHCl溶液终止反应，离心取上清液测AM含量，在上述条件下每min产生1umolAM的酶量定义为一个酶活单位(u)。

　　1.2.9水合反应液蛋白含量测定

　　蛋白质的测定按照考马斯亮兰G-250方法，以牛血清蛋白做标准。

　　1.2.10凝聚法细胞、游离细胞、海藻酸钡凝胶法细胞和发酵液储存稳定性比较

　　将上述四种形式的细胞分别置于去离子水中，放入冰箱中2～4℃保存。按1.2.8方法每隔10天测定一次酶活力。

　　2.结果与讨论

　　2.1菌株的分类鉴定情况

　　由实验观察鉴定情况来看，本实验所用菌株为革兰氏阴性棒状杆菌。

　　2.2不同种类和浓度的PAM对菌株的吸附情况

　　加入到发酵液中的不同种类和浓度的PAM溶液，实验表明，添加阳离子PAM的凝聚效果最好。因此，本实验选用的凝聚剂为阳离子PAM。最佳阳离子PAM溶液浓度为0.35-0.45%,加入量为每升发酵液加折纯PAM0.40-0.50g。加入量过低则菌株絮团过于分散，不利于菌株絮团的分离和清洗，加入量过高则菌株絮团粘度过大，超过一定量则不起凝聚作用。
　　2.3凝聚法细胞、游离细胞、海藻酸钡凝胶法细胞和发酵液存放时间比较

　　将上述四种形式的细胞分别置于去离子水中，放入冰箱中2～4℃保存。每隔10天测定一次酶活力，结果凝聚法细胞酶活性较稳定，半衰期为28.9天。游离细胞次之，为25.3天。而发酵液和海藻酸钡凝胶法固定化细胞酶活性稳定性较差，半衰期分别为19.5天和23.6天。分析原因主要为后两种细胞受pH值、无机离子等因素的影响下容易失去活性。

　　2.4三种固定化细胞最佳反应条件的确定及批式反应的批次、产率和产量对比

　　使用同一批次的发酵液，经处理后进行催化水合反应，确定最佳反应条件并统计三种细胞的AM累积速率和累积量，由表1可以说明凝聚法具有良好的操作稳定性和较长的使用寿命。

　　 表1 三种细胞批式催化水合反应产率和产量对照表

　　2.5 水合液中菌体、杂蛋白含量和电导率值比较

　　由革兰氏染色法、考马斯亮兰法及电导率仪可检测出三种细胞催化反应出的水合液中菌体、杂蛋白的含量和电导率值。实验表明凝聚法细胞生产的AM水剂,在菌体、杂蛋白含量和电导率值三个指标比海藻酸钡凝胶法细胞及游离细胞要好,主要原因是凝聚法细胞在固定化时能有效去除发酵液中的电解质、发酵次级代谢产物和残留培养基等杂质,同时在反应过程中阳离子PAM能有效吸附反应液中的游离细胞、细胞碎片等杂质。结果如表2所示：