以动植物油脂为原料，用甲醇或乙醇在催化剂作用下经酯交换制成。动植物油脂的主要成分为长链脂肪酸的甘油酯（甘油三酸酯），与甲醇或乙醇反应，生成甘油和长链脂肪酸甲酯或乙酯，长链脂肪酸单烷基酯可用作柴油机燃料。称为生物柴油。生物柴油可与石油柴油混用，也可单独使用。
美国和德国已小规模生产生物柴油，美国主要用大豆油为原料，德国用油菜籽油和动物脂肪等为原料。两国并订有生物柴油的国家标准，除了与石油柴油相同的一些项目指标外，还规定了对游离甘油和总甘油量的限制。
中国对生物柴油也有研究，并开始小规模试生产。
